Meeus، I.، et al. تأثير الإصابة بالفم بفيروس نحل كشمير وفيروس الشلل الإسرائيلي الحاد على النحل الطنان (Bombus تيريستريس) النجاح الإنجابي. J. اللافتري. باتول. (2014) ، http://dx.doi.org/10.1016/j.jip.2014.06.011 ملخص فيروس الشلل الحاد الإسرائيلي (IAPV) مع فيروس شلل النحل الحاد (ABPV) وفيروس نحل كشمير (KBV) تشكل مجموعة من فيروسات dicistroviruses وثيقة الصلة. إنهم مشهورون بارتفاع معدل الوفيات لديهم بعد الحقن في نحل العسل. تم الإبلاغ عن هذه الفيروسات أيضًا في ملقحات غير-أبيس non-Apis hymenopteran مثل النحل الطنان ، الذي أصيب بـ IAPV عند وضعه في نفس الدفيئة باستخدام IAPV خلايا نحل العسل المصابة. قمنا هنا بإصابة شغالات Bombus terrestris شفويا بجرعات مختلفة من الجسيمات الفيروسية IAPV أو KBV. تم إثبات نجاح العدوى من خلال تحليل النحل الطنان بعد دراسات التأثير: 50 يومًا بعد الإصابة. جرعات 0.5 10 7 و 1110 جسيم فيروس لكل نحلة كانت معدية خلال هذه الفترة ، لـ IAPV و KBV على التوالي ، بينما كانت جرعة 0.5 10 6 جسيمات IAPV لم تكن معدية. تمت دراسة تأثير الإصابة بالفيروس في المستعمرات الدقيقة المكونة من النحل الذي تصبح إحداها ملكة زائفة تشرع في وضع بيض غير مخصب (ذكور). كانت معاملات التأثير المدروسة هي: إنشاء ملكة زائفة ، وتوقيت البيضة - عدد ذكور المنتجة ووزن هذه الذكور وعدد وفيات الشغالات. في هذا الإعداد أدت عدوى KBV إلى تباطؤ كبير في بدء تشغيل الخلية وإنتاج النسل ، في حين أن 41 فقط يمكن الإبلاغ عن الأخير لـ IAPV. ولم يؤد أي من الفيروسين إلى زيادة معدل وفيات العمال عند تناول جرعات فموية. نحن نسجل- أوصي بمزيد من الدراسات حول كيفية انتقال هذه الفيروسات بين أنواع الملقحات المختلفة. وهي أيضًا حيوي لفهم كيف يمكن لانتشار الفيروس أن يؤثر على تجمعات النحل البري بسبب اضطراب في الطبيعة قد يؤدي ارتباط الفيروسات المضيفة أورال إلى تدهور الوضع المهددة بالفعل بالانقراض الخطير للعديد من النحل الطنان محيط. 3. النتائج 3.1 ـ حالة الاصابة بالعدوى الملكة الزائفة لمستعمرة صغيرة ، تلك التي تضع البيض ، التأثير الأكبر على أداء مستعمرتها الدقيقة. لذلك قمنا باختبار حالة الإصابة بالفيروس من الزائفة الملكات بعد تطوير المستعمرات الدقيقة لمدة 50 يومًا. ستة من أصل 10 ملكات زائفة تم علاجها بـ IAPV و 9 ملكات من أصل 10 تم علاجها بـ تم اختبار الملكات الزائفة إيجابية للعدوى بـ ABPV-KBV- فيروس معقد IAPV ، باستخدام تقنية BeeDoctor RT-MLPA ، بينما أيا من الفيروسات الأخرى التي يغطيها BeeDoctor (De Smet وآخرون ، 2012). IAPV- تفاعلات RT-PCR الخاصة بـ KBV ، متبوعًا بتسلسل منتجات RT-PCR ، أكد ذلك نتج عن علاج IAPV فقط عدوى IAPV وعلاج KBV- منة فقط في عدوى KBV. مراقبة الملكات الزائفة وكذلك والنحل الطنان يتلقى تخفيفًا بمقدار 10 أضعاف من مخزون IAPV (ن = 10) كانت خالية تمامًا من أي فيروسات يغطيها BeeDoctor. 3.2 تأثير الإصابة بالفيروسات على تطور مستعمرة النحل الطنان لم ينتج عن الإصابة بأي من IAPV أو KBV أي 280 إصابة رئيسية زيادة في معدل وفيات عمال النحل الطنان. علاج ال IAPV- منة نتج عنها مقتل 6 عمال من أصل 50 عاملاً بحلول اليوم 50 ؛ كان لدى علاج KBV عامل واحد ميت فقط ، وعلاج التحكم - منة كان لديها 3 عمال قتلى من أصل 50. تتطور المستعمرات الدقيقة للنحلة الطنانة بشكل متوقع جدًا تحت شروط غذائية قياسية وموحدة ، مع وضع البيض ابتداء من 7-8 أيام بعد إدخال النحل في مستعمراتهم الدقيقة ، مع عادة ما لا يزيد عن يوم واحد من الاختلاف في الوضع بين كولو- nies (ميوس وآخرون ، 2013). ومع ذلك ، في هذه التجارب حُرمت المستعمرات الدقيقة من حبوب اللقاح لمدة 3 أيام ، أي تأخر وضع البيض إلى متوسط ​​11 يومًا في المجموعة الضابطة ، وزاد أيضًا التباين في وقت وضع البيض حول يقصد. وبالتالي ، فإن الوقت حتى وضع البيض في هذه التجارب 30- لم تظهر المستعمرات الدقيقة الوراثية والضابطة توزيعًا طبيعيًا - بوتيون (عينة واحدة من اختبار كولموغوروف - سميرنوف ، P = 0.00014). كان لدى المجموعة الضابطة معدل رباعي (IQR) قدره 1 ، وكل شيء أقل من Q1-1.5 IQR = 8.8 ، وكل شيء أعلى من Q3 + 1.5 معدل الذكاء = 12.5 هو شاذ. بناءً على هذا رأينا مجموعتين: تلك مع 9 أو 10 أو 11 أو 12 يومًا حتى وضع البيض ("المستعمرات العادية") وأولئك الذين لديهم وضع بيضوي يبدأ في اليوم 13 أو ما بعده ("عمود مؤجل - onies '). كانت هناك مستعمرتان من كل 10 مستعمرات مع تأخر وضع البيض في المجموعة الضابطة 4 من أصل 10 في المجموعة المعالجة بـ IAPV و 6 من أصل من 10 في المجموعة المعالجة بـ KBV (الجدول 1 أ). الفرق بين المستعمرات المعالجة بـ KBV ومستعمرات التحكم مهمة ، مثل تم تحديده بواسطة v 2 Goodness of Fit Test. علاج KBV أيضا دقيقة بشكل ملحوظ مع عدم وجود طائرة بدون طيار pro- على الإطلاق مقارنة بعينات التحكم ؛ هذا التأثير لم يكن تحدث لعلاج IAPV (الجدول 1 ب). سيؤثر التأخير في وضع البيض على العدد الإجمالي من الذكور التي تنتجها هذه المستعمرات. لذلك استخدمنا فقط المستعمرات ذات الوقت "العادي" لوضع البيض (10-12 يومًا الصورة بعد البداية- حتى التجربة) لمقارنة إنتاج الذكور بين المعالجة- إشارات. أشارت ANOVA إلى اختلاف كبير في أعداد تم إنتاج الذكور بين العلاجات (F (2،15) = 4.127 ؛ P = 0.036). استخدام اختبار Tukey اللاحق لتحديد العلاج الذي تسبب في التأثير ، رأينا أن كلا العلاجين (KBV و IAPV) أنتجا عدد الذكور أقل من مستعمرات التحكم ، مع احتمال 0.07 (رسم بياني 1). استبعدت هذه المقارنات المستعمرات الدقيقة بـ آي ميوس وآخرون. / مجلة أمراض اللافقاريات xxx (2014) xxx – xxx 3 YJIPA 6571 عدد الصفحات 6 ، نموذج 5G 9 يوليو 2014 4 I. Meeus et al. / Journal of Invertebrate Pathology xxx (2014) xxx–xx Meeus, I., et al. Effect of oral infection with Kashmir bee virus and Israeli acute paralysis virus on bumblebee (Bombus terrestris) reproductive success. J. Invertebr. Pathol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.jip.2014.06.011 ================= bstract Israeli acute paralysis virus (IAPV) together with Acute bee paralysis virus (ABPV) and Kashmir bee virus 29 (KBV) constitute a complex of closely related dicistroviruses. They are infamous for their high mortality 30 after injection in honeybees. These viruses have also been reported in non-Apis hymenopteran pollinators 31 such as bumblebees, which got infected with IAPV when placed in the same greenhouse with IAPV 32 infected honeybee hives. Here we orally infected Bombus terrestris workers with different doses of either 33 IAPV or KBV viral particles. The success of the infection was established by analysis of the bumblebees 34 after the impact studies: 50 days after infection. Doses of 0.5  10 35 7 and 1  107 virus particles per bee were infectious over this period, for IAPV and KBV respectively, while a dose of 0.5  10 36 6 IAPV particles per bee was not infectious. The impact of virus infection was studied in micro-colonies consisting of 5 37 bumblebees, one of which becomes a pseudo-queen which proceeds to lay unfertilized (drone) eggs. 38 The impact parameters studied were: the establishment of a laying pseudo-queen, the timing of egg- 39 laying, the number of drones produced, the weight of these drones and worker mortality. In this setup 40 KBV infection resulted in a significant slower colony startup and offspring production, while only the 41 latter can be reported for IAPV. Neither virus increased worker mortality, at the oral doses used. We rec- 42 ommend further studies on how these viruses transmit between different pollinator species. It is also 43 vital to understand how viral prevalence can affect wild bee populations because disturbance of the nat- 44 ural host-virus association may deteriorate the already critically endangered status of many bumblebee 45 species. 3. Results 263 3.1. Infection status 264 The pseudo-queen of a micro-colony, the one that lays the eggs, 265 has the highest impact on the performance of her micro-colony. 266 Therefore we tested the virus infection status of the pseudo- 267 queens after following micro-colony development for 50 days. Six 268 out of 10 IAPV-treated pseudo-queens and 9 out of 10 KBV-treated 269 pseudo-queens tested positive for infection with an ABPV–KBV– 270 IAPV complex virus, using the BeeDoctor RT-MLPA technology, 271 while none of the other viruses covered by BeeDoctor (De Smet 272 et al., 2012) were detected. IAPV- KBV-specific RT-PCR reactions, 273 followed by sequencing of the RT-PCR products, confirmed that 274 IAPV treatment resulted only in IAPV infections and the KBV treat- 275 ment only in KBV infections. The control pseudo-queens as well as 276 and bumblebees receiving a 10-fold dilution of the IAPV stock 277 (n = 10) were entirely free of any virus covered by the BeeDoctor. 278 3.2. Impact of virus infection on bumblebee colony development 279 Infection with either IAPV or KBV did not result in any major 280 increase in mortality of the bumblebee workers. The IAPV treat- 281 ment resulted in 6 dead workers out of 50 workers by day 50; 282 the KBV treatment only had 1 dead worker, and the control treat- 283 ment had 3 dead workers out of 50. 284 Bumblebee micro-colonies develop very predictably under 285 standard, uniform nutritional conditions, with oviposition starting 286 7–8 days after introducing the bees into their micro-colony, with 287 usually no more than 1 day variation in oviposition between colo- 288 nies (Meeus et al., 2013). However, in these experiments the 289 micro-colonies were deprived from pollen for 3 days, which 290 delayed oviposition to a mean of 11 days in the control group, 291 and also increased the variation in oviposition time around this 292 mean. Consequently, the time until oviposition in these 30 exper- 293 imental and control micro-colonies did not show a normal distri- 294 bution (One-Sample Kolmogorov–Smirnov Test, P = 0.00014). The 295 control group had an interquartile (IQR) of 1, everything lower 296 than Q1-1.5  IQR = 8.8, and everything higher than Q3 + 1.5  297 IQR = 12.5 is an outlier. Based on this we saw two groups: those 298 with 9, 10, 11 or 12 days until oviposition (‘‘regular colonies’’) 299 and those with oviposition starting at day 13 or later (‘‘delayed col- 300 onies’’). There were 2 out of 10 colonies with delayed oviposition in 301 the control group; 4 out of 10 in the IAPV-treated group and 6 out 302 of 10 in the KBV-treated group (Table 1a). The difference between 303 the KBV-treated colonies and control colonies is significant, as 304 determined by a v 305 2 Goodness of Fit Test. KBV treatment also resulted in significantly more micro-colonies with no drone pro- 306 duction at all compared to control samples; this effect did not 307 occur for IAPV treatment (Table 1b). 308 The delay in oviposition will further influence the total number 309 of drones produced by these colonies. Therefore we only used the 310 colonies with a ‘‘regular’’ oviposition time (10–12 days after start- 311 up of the experiment) to compare drone production between treat- 312 ments. The ANOVA indicated a significant difference in numbers of 313 drones produced between the treatments (F(2,15) = 4.127; P = 0.036). 314 Using the post hoc Tukey test, to determine which treatment caused 315 the effect, we saw that both treatments (KBV and IAPV) produced 316 fewer drones than the control colonies, with a probability of 0.07 317 (Fig. 1). These comparisons excluded the micro-colonies with 318 I. Meeus et al. / Journal of Invertebrate Pathology xxx (2014) xxx–xxx 3 YJIPA 6571 No. of Pages 6, Model 5G 9 July 2014 Please cite this article in press as: Meeus, I., et al. Effect of oral infection with Kashmir bee virus and Israeli acute paralysis virus on bumblebee (Bombus terrestris) reproductive success. J. Invertebr. Pathol. (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.jip.2014.06.011 319 delayed oviposition time, which reduces the statistical power of the 320 comparisons. When we compare all IAPV-treated micro-colonies 321 that produce drones, irrespective of oviposition time, to similar 322 micro-colonies from the control group, than we see a significant 323 drop in drone production in IAPV-treated colonies (N = 18; Mann 324 Whitney U test: z = 17.5; P = 0.04). Furthermore, drone production 325 in all virus-treated colonies combined (i.e. both KBV and IAPV) 326 was significantly reduced when compared with the control colonies 327 (F(1,16) = 8.828; P = 0.009) (Fig. 1). 328 The same analyses applied to drone mass for all drone-produc329 ing micro-colonies, revealed a lower mean mass of the drones in 330 virus-treated colonies compared to control colonies, although this 331 difference was not significant (F(2,18) = 1.801; P = 0.194) and 332 F(1,19) = 1.782; P = 0.198). 333 4. Discussion 334 There is extensive historical literature on the effects of ABPV 335 and KBV on honeybees (for reviews see Ribière et al. (2008) and de Miranda et al. (2010)). Both viruses have been implicated in 336 Varroa-associated colony losses (de Miranda et al., 2010; Ribière 337 et al., 2008). More recent European data links ABPV with honeybee 338 winter mortality (Genersch et al., 2010b; Siede et al., 2008). IAPV, 339 which was only recently described as a separate virus (Maori 340 et al., 2007), has also been implicated as a marker for Colony 341 Collapse Disorder (CCD) in North America (Cox-Foster et al., 342 2007), although this was re-assessed in subsequent, more compre- 343 hensive studies (vanEngelsdorp et al., 2009). Instead mortalities 344 have been linked to KBV and ABPV infections (Cornman et al., 345 2012) and overall pathogen load as an indicator of compromised 346 honeybee health (Ravoet et al., 2013). Despite the acute virulence 347 of these viruses in honeybees and their ability to infect other 348 hymenopteran species, including bumblebees (Bailey and Gibbs, 349 1964; Singh et al., 2010), few systematic host-range studies have 350 been conducted for any of these viruses. Moreover, no study to 351 date has investigated their impact on such alternative hosts. Using 352 the buff-tailed bumblebee, a generalist forager in the Palearctic 353 region, we demonstrate that oral feeding of 0.5  10 354 7 and 1  107 viral particles per bee of either IAPV or KBV, respectively, results 355 in an active infection and fitness loss. Lower doses of IAPV 356 (0.5  10 357 6 IAPV particles/bee) did not result in a detectable infection. Thus, our oral administration dose is close to the minimum 358 required for inducing an infection, and may not have been suffi- 359 cient to affect worker mortality. This may also explain the slightly 360 reduced virulence of IAPV compared to KBV in these experiments, 361 since the KBV infectious dose was twice that of IAPV. Experiments 362 elsewhere showed that oral infection of B. terrestris workers with 363 10 364 9 genome copies of a different honeybee virus, DWV, reduced the mean survival of B. terrestris workers by 6 days (Fürst et al., 365 2014). 366 With KBV-infected bumblebees, the time until oviposition was 367 delayed and fewer colonies initiated drone production than with 368 uninfected bumblebees. We speculate that the exclusion of pollen 369 in the first 3 days of the experiment exacerbated these effects, as 370 pathogenic effects are often context dependent, with low nutri- 371 tional status being an important stressor for pathogen infections 372 (Brown et al., 2003). In colonies without delayed oviposition, drone 373 production was also impaired. We can thus conclude that under 374 the experimental conditions KBV infection reduces B. terrestris 375 fitness. 376 For IAPV the situation is less obvious. IAPV-infected bumble- 377 bees showed deviations in time until oviposition and drone pro- 378 duction, but these were not significant. However, when we only 379 analyze micro-colonies with drone production, we see that IAPV- 380 infected colonies produce significantly fewer drones than non- 381 infected colonies. We can therefore conclude that IAPV impacts 382 B. terrestris fitness as well. The lower virulence of IAPV in these 383 experiments, relative to KBV, may be partly due to the lower IAPV 384 infectious dose used (half that of KBV). 385 Here we report fitness impact of KBV and IAPV, and Fürst et al. 386 (2014) showed lower survival after DWV infection (Fürst et al., 387 Table 1 The number of micro-colonies with a regular and delayed time until oviposition (a), and with a without drone production (b). (a) The number of micro-colonies (mean oviposition day) Regular oviposition Delayed oviposition v2 Control 8 (10.5) 2 (16.5) Expected IAPV 6 (10.5) 4 (14) Observed v2 = 2.5, df = 1, P = 0.11 KBV 4 (10.5) 6 (16.3) Observed v2 = 10, df = 1, P = 0.002 (b) The number of micro-colonies With drone production Without drone production v2 Control 9 1 Expected IAPV 9 1 Observed v2 = 0, df = 1, P = 1 KBV 5 5 Observed v2 = 17.778, df = 1, P < 0.001 Fig. 1. The mean number of drones produced (±SE) and their mean mass (±SE) for Israeli acute paralysis virus- and Kashmir bee virus-infected bumblebee microcolonies versus their control. Dicistroviruses represents the pooled data of both IAPV and KBV infection. 4 I. Meeus et al. / Journal of Invertebrate Pathology xxx (2014) xxx–xx